细胞RNA快速提取试剂盒
货号：U10018A
规格：100T
储存：
价格：￥900元
·产品描述
本试剂盒可以从少量的生物样品中快速提取高质量的总RNA， 不使用酚和氯仿等有毒物质。具有操作简单快速、稳定性高、无毒的优势。适用于细胞RNA的提取，提取得到的总RNA可用于RT- PCR、qPCR、Northern blotting、cDNA文库构建等多种实验。本试剂盒由裂解液、清洗液、洗脱液组成， 其中裂解液(Lysis Buffer) 中含有强变性剂和RNA酶抑制剂，能够迅速裂解样品并失活RNA酶，确保操作过程中RNA的完整性。本试剂盒大致的操作过程如下：首先用裂解液裂解样品；裂解好的样品加入乙醇混匀即可上柱， 离心去掉液体将RNA结合在柱子上；杂质在清洗过程中被有效去除；洗脱RNA并用于下游实验。整个提取过程仅需10分钟。
·产品组成
* 第一次使用前，须向Wash Buffer加48ml 无水乙醇
·保存方法
·使用建议
1. 样品裂解
1.1 对≤3x106/孔的贴壁细胞：
1) 吸干培养基，用适量的PBS洗1次；
2) 加入500μl的Lysis Buffer，枪头吹吸或搅拌数次，直至细胞完全裂解。转移至EP管中，vortex 10秒钟
以充分裂解细胞；
1.2. 对＞3 x 106/孔的贴壁细胞或悬浮细胞：
1)（本步适用于贴壁细胞。对于悬浮细胞，从步骤2开始操作）用胰酶消化将贴壁细胞悬浮起来；
2)取1~3x106个细胞的悬液至1.5 ml离心管，500 g离心3分钟收集细胞；
3)去上清，离心管中留约10~20 μl PBS，轻弹离心管重悬细胞沉淀；
4)加入500 μl的Lysis Buffer，用力吹吸10次，vortex 10秒钟，保证细胞完全裂解；
2. 上柱/RNA提取
1)向裂解的细胞中加入等体积的无水乙醇充分混匀（可能会产生沉淀,这是正常现象，继续进行操作即可）。可将离心管剧烈颠倒几次，或用移液器用力吹吸10次，然后将液体转移至离心柱上。
2) 4,000 g离心1分钟（相当于7000 rmp左右，如离心柱上仍有液体残留可增加转速至12,000 g离心）。
3. 柱清洗
1) 向RNA柱中加入500μl的Wash Buffer，12,000 g离心1.5分钟（离心结束后取出柱子时注意不要让收集管内的废液接触到RNA柱，以免污染。可以倒掉废液,将RNA柱装回收集管，空管离心一次，能完全去除可能残留的Wash Buffer）。
2) 可选操作：若实验对基因组的少量残留极其敏感，可用试剂盒附赠的DNA酶处理，具体处理方法详见最后一页:［常见问题及解决方案］ 第4条。如果使用的逆转录试剂盒含DNA酶，则可省略本试剂盒的DNA酶处理。
3) 将柱子放到干净的无RNA酶的1.5 ml离心管上，开盖晾干2分钟。此步骤为了彻底去除残余的乙醇。
4. RNA洗脱
1)在RNA柱的膜中心部位加入30 μl的Elution Buffer，室温静置2分钟。
2)12,000g离心1分钟（洗脱下来的RNA溶液重新加入柱中，静置2分钟，再次离心可提高洗脱效率，得到更多RNA）。（RNA洗脱下来后,建议置于冰上。）
3)测定洗脱的RNA浓度,以便于后续实验使用。提取出来的RNA可立即用于后续实验，也可保存在-80°C备用。
关于RNA浓度与纯度：本试剂盒提取RNA，使用Nanodrop等微量分光光度计测定0D 260/280在1.90~2.2之间均属正常（因不同仪器之间存在误差，若OD比值略有超出，但上下不超过0.1，且吸光度曲线正常，则亦可接受）。经检测，对于少量细胞或组织样品，使用本试剂盒提取的RNA浓度最低不低于30ng/ul即可使用。
·实验结果
·常见问题解决方案
RNA产量过低，或用已经验证过的引物检测基因表达，检测到的内参基因Ct值偏大，或无法做出正常的扩增结果。
解决办法：
a. 检查所使用的试剂是否受到污染：建议试剂盒开封后, 每种buffer分装为2份每次使用时应严格按照规溯作，防止交叉污染。
b. 溶解好的引物应该分装为小份冻存，以减少引物降解及降低污染的可能性。
c. 检查操作流程是否正确，例如：
1. 除DNA酶以外的所有试剂均须室温保存。若冷藏保存，应提前取出，温度恢复至室温之后方可使用。整个RNA提取的操作过程必须在室温进行，不可置于冰上（直至洗脱离心后得到 RNA方可置于冰上），以避免其间产生不溶物堵塞离心柱；
2. Wash Buffer使用前需加入48毫升无水乙醇混匀才可使用；
3. 细胞裂解产物，上柱前需要加入等体积的无水乙醇，充分混匀后加入离心柱中离心；
4. 可选步骤：若实验对基因组的少量残留极其敏感，可用试剂盒附赠DNA酶处理：RNA经wash buffer清洗一次后，按照每个样品2 μl DNase + 2 μl 10x Reaction buffer加16 μl DEPC水（或Elution Buffer），混匀后加入离心柱中央，室温放置5分钟，然后加入 Wash Buffer清洗一次去除DNA酶，进行后续操作；
5. 洗涤时需用12,000 g高速离心充分去除Wash Buffer，然后开盖晾干2分钟；
6. 洗脱液的体积可以根据需要在一定范围内调整（一般20-50μl，最少不可少于10 μl ,否则无法充分溶解RNA）,以浓度满足后续实验需求为宜。重复洗脱一次及延长放置时间至5分钟均可提高RNA产量。
7. 若细胞体积较大以往采用TRIzol试剂提取RNA时需用100 mm培养皿培养细胞, 建议使用本试剂盒时仍然使用35mm培养皿培养细胞，本试剂盒最低可提取5万个左右常规细胞的RNA（T、B细胞等体积极小的细胞除外），能满足绝大多数逆转录和qPCR的实验需要。经测试，本试剂盒最多大约可提取30μg左右的总RNA。
